一、 疾病名称

须部假性毛囊炎 (PseudofolliculitisBarbae, PB)

二、 PB简介

角蛋白病是一大类皮肤遗传性疾病，有些角蛋白的表达异常可造成皮肤附属器的异常。须部假性毛囊炎患者的胡须毛干离开毛囊前穿进皮肤或从别处离开毛囊，屈曲，再进入邻近皮肤产生刺激，产生异物炎性反应，出现非感染性的小脓疱。部分患者是由于角蛋白基因的突变导致发病。须部假性毛囊炎（Pseudofolliculitis barbae, PFB），也称piliincarnate，“毛发向内生长”或“剃刀磕碰”，是一种常见的人类毛发疾病。通常发生在面部胡须区域，但也可在头皮、颈部和腹股沟。表现为毛发剃除后毛发不直接从毛囊内长出，而是容易卷曲进入皮肤，导致炎症发生。PFB的皮肤发红，发痒，有时类似丘疹外观。2004年，在患有PFB家族的两名病人中，Winter发现了一个KRT75基因的杂合SNP位点（A12T）。在一个200人的群体中，他发现A12T这一SNP位点在非裔美国人中的分布大概是白种人的3倍。随后的回归分析表明，弯曲的毛囊和这个SNP有相关性。

三、 Krt75与PB

须部假性毛囊炎小鼠的突变位点位于位于Krt75是第159位碱基。此突变为框内三碱基删除（AAC），导致第159位的天冬酰胺（N）缺失（N159del）。此突变虽然与造成须部假性毛囊炎的Krt75的错义突变(丙氨酸->苏氨酸，A12T)不完全一致，但是，因为须部假性毛囊炎小鼠模型所携带的突变位于Krt75的杆域，而且与另外一种显性遗传性皮肤病（先天性厚甲症）中最常见的突变位点完全一致（Krt6A的缺失突变，N171del），所以，携带N159del缺失突变的小鼠不但可以在基因型上可以模拟遗传性皮肤病，而且，可以更突出地表现出该基因突变造成的表型改变。

该模型受赠于Dennis R. Roop实验室 ，现将模型 的制作方法介绍如下：

小鼠的Krt75蛋白与人的Krt6A蛋白的N端的氨基酸序列具有高度的同源性，即小鼠的Krt75与人的Krt6A相对应。人的Krt6A的显性位点的失活突变是造成先天性甲肥厚（Pachyonychia Congenita，PC）最常见的突变，PC是另一种少见的甲肥厚性遗传性皮肤病，于1906年由Jadassohn和Lewandowsky首先命名。目前已经确定其中频率最高的突变是172密码子的却是突变，该密码子编码一个天冬酰胺（N）。已有研究显示该突变造成的缺陷导致Krt6a的合成出现障碍，从而干扰蛋白质组装成角蛋白骨架的功能。因此，我们设计了一个删除N159(N159del) 从而导致Krt75蛋白出现一个显性位点的失活突变(Krt75tm1Der)。

构建小鼠Krt75 N159del突变表达载体，这一突变等同于人KRT6A N172del突变。向重组的ES细胞电转一个cre表达载体。得到的目的ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠囊胚中。得到的嵌合体小鼠与C57BL/6J回交，得到的携带有目的等位基因（t/Krt75tm1Der），鼠尾DNA用于PCR检测。杂合子小鼠（t/Krt75tm1Der）互交后得到纯合子仔鼠（Krt75tm1Der/Krt75tm1Der）。（图1）

1. 基因型和蛋白表达鉴定

提取小鼠基因组DNA， 用PCR 扩增检测插入突变，鉴定基因型（图2a）。取小鼠皮肤样品提取mRNA，半定量RT–PCR检测突变Krt75在小鼠中的表达（图1b）。

图1：a：Krt75tm1Der基因敲入小鼠的PCR鉴定；b：半定量 RT–PCR检测突变Krt75在小鼠中的表达。

2、Krt75tm1Der基因敲入小鼠模型表型检测

⑴. 大体表型：

Krt75tm1Der纯合突变小鼠在两周龄时即出现明显的全身毛发粗糙不光滑的表现，杂合子的小鼠毛发也有类似的表现，但不如纯合子小鼠严重。这种毛发的缺陷不受限于毛发的分布区域、毛发的种类和小鼠的年龄。突变小鼠的毛干能看到明显的病理改变，如：色素的异常凝集，毛干中间异常凸起，毛干结构脆弱甚至折断。（图2）

图2：Krt75tm1Der基因敲入小鼠大体表型：a.野生型小鼠的毛光滑整洁；b. Krt75tm1Der / Krt75tm1Der突变纯合子小鼠毛粗糙。c,d. 野生型小鼠的正常毛干；Krt75tm1Der突变小鼠毛干的典型改变：e-g. 色素的异常凝集，h-n.毛干中间的异常凸起，o. 毛干结构脆弱，p.毛干折断断端。标尺100μm。

⑵. 甲的表型：

Krt75tm1Der突变小鼠的甲较野生型小鼠容易脱落，成年小鼠的甲逐渐长长增厚。近距离放大观察小鼠的甲表面粗糙，横向纵向均有增厚，导致“滑雪道样”的改变。组织学观察甲床和其下方的结缔组织分离，并有较大面积的出血，可能是由于早期病变导致的甲板撕裂所致。甲板的过度生长可能与甲板下方的颗粒层和角质层超过正常范围的扩张有关。这些病理变化的结果就是甲板的附着力下降，抓握粗糙表面之后容易脱落。（图3）

图3：Krt75tm1Der基因敲入小鼠甲的表型：a- c野生型小鼠的甲，d-f Krt75tm1Der突变纯合子小鼠的甲，突变小鼠的甲较野生小鼠长且厚，病理组织切片显示甲板弯曲，甲床内有出血。（a,b,d,e）标尺200μm，（c,f）标尺500μm。

⑶. 毛囊的表型：

8周龄的Krt75tm1Der突变小鼠的部分毛囊类似正常，但其他毛囊明显肿胀。毛干根部有明亮的嗜酸性染色，这些缺少核染色的细胞形成“鬼影”细胞，随着相对正常的毛干生长，这些肿胀的细胞团被逐渐推向皮肤表面。（图4）

图4：8周龄Krt75tm1Der基因敲入小鼠毛囊的表型：a突变小鼠的部分毛囊类似正常；b毛干根部的细胞开始出现嗜酸性增加；c,d嗜酸性的变化逐渐发展，正常和核染色逐渐减少消失，细胞残留物形成一团；e相对正常的毛干继续生长，将异常的团块样结构推向皮肤表面。标尺50μm

⑷. 毛干的表型：

Krt75tm1Der突变小鼠的毛干异常，毛干在显微镜下观察可看到典型的“鼓包”结构，这种结构的出现导致毛发易折断。扫描电镜可更为直观的观察到毛干的这些病理改变。（图5）

图5：Krt75tm1Der基因敲入小鼠毛干的表型：a-e光学显微镜下毛干的改变，局部的肿胀，毛干髓质的细胞聚集，及断裂毛干的断端；f-j扫描电镜下毛干的改变，毛干局部的肿胀，表面的角质层破裂，及断裂的毛干断端。